جدول4-1-3- صفات ارزیابی شده رقیق کننده حاوی سطوح مختلف زرده تخم مرغ اسپرم قوچ افشاری پس از انجماد 39
جدول4-1-4- مقایسه ویژگی های حرکتی(مربوط به CASA) اسپرم قوچ افشاری در بین تیمارهای اختصاص یافته 41
جدول4-1-5- صفات ارزیابی شده رقیق کنندههای حاوی سطوح مختلف لسیتین و زرده تخم مرغ اسپرم قوچ افشاری پس از انجماد 42
فهرست نمودارها
عنوان صفحه
نمودار 4-1-1 مقایسه سطوح مختلف لسیستین اسپرم قوچ افشاری پس از انجماد39
نمودار 4-1-2 مقایسه سطوح مختلف زرده تخم مرغ اسپرم قوچ افشاری پس از انجماد40
چکیده
فرایند انجماد و ذوب اسپرم شامل در معرض قرار گرفتن ابتدایی اسپرم با مواد محافظ انجمادی، کاهشدما به زیرصفر درجه سلسیوس، ذخیره، ذوب و سرانجام حذف ماده محافظ انجمادی و بازگشت به حالت طبیعی است. این تغییرات باعث آسیبهای ساختاری و بیوشیمیایی به اسپرم میشود که میتواند زندهمانی و باروری اسپرم را تحت تاثیرقرار دهد. هدف از این پژوهش، بررسی اثر سطوح مختلف لسیتین(5/0، 1، 5/1 و 2 %) و زرده تخم مرغ(10، 15، 17 و 20 %) در رقیقکننده پایه تریس- فروکتوز (همراه با 5 درصد گلیسرول) پسازفرآیند انجمادو یخ‌‌گشایی بود. نمونه‌های منی توسط واژن مصنوعی از 4 راس قوچ افشاری بالغ، هفتهای 2 بار جمعآوری شد. نمونههای منی رقیق شده در معرض بخار ازت منجمد و در تانک حاوی ازت مایع ذخیره شد و سپس یخگشایی پایوتهای حاوی اسپرم در آب گرم 37 درجه سلسیوس انجام شد. تحرککلوتحرک پیشرونده اسپرم با کمک سامانه آنالیز رایانه‌ای اسپرم اندازهگیری شد. سلامت غشا، درصد اسپرمهای زنده و مورفولوژی اسپرمها بعد از فرایند یخگشایی اندازهگیری شد. نتایج حاصل از این آزمایش نشان داد که رقیق‌کننده حاوی 5/1% لسیتین و 15% زرده تخممرغ در مقایسه با سایر سطوحهای آزمایشی موجب بهبود معنیدار در میزان تحرک کل، تحرک پیشرونده، یکپارچگیغشا و اسپرمهایزنده شد (01/0p < ). سطوح مختلف لسیتین و زرده تخم مرغ اثر معنیداری روی مورفولوژی اسپرمها نداشتند (05/0p > ). مطابق با نتایج این پژوهش به نظر می‌رسد که افزودن 5/1% لسیتین و 15% زرده تخممرغ به رقیق‌کنندههای انجماد اسپرم قوچ افشاری باعث بهبود معنیدار فراسنجههای اسپرم از جمله تحرک و درصد اسپرمهای زنده می?شود.
کلید واژه ها : لسیتین، رقیق کننده، اسپرم منجمد، قوچ افشاری

فصـل اول
کـلیات
1-1-پرورش گوسفند
پرورش گوسفند در ایران دارای قدمت تاریخی بسیار طولانیمیباشد که هم اکنون ایران با داشتن 55 میلیون راس گوسفند، در رتبه چهارم جهان قرار دارد. اما متاسفانه به علت عدم بازده تولید مثلی و عدم استفاده از تلقیح مصنوعی در صنعت پرورش گوسفند، صرفه اقتصادی خوبی از این صنعت به دست نیامده و رشد چندانی نکرده است. بنابراین این مطالعه در مرحله اول به منظور انجماد منی قوچ با رقیق کنندههای بر پایه منشا گیاهی(لسیتین سویا) و حیوانی(زرده) برای بهبود کیفیت مناسب اسپرم بعد از فرآیند انجماد-ذوب و در مرحله دوم به منظور ارزیابیعملکرد این رقیق کنندهها با تست‌هایآزمایشگاهی مهممرتبط با توان باروری اسپرم صورت گرفت. نتیجه استفاده از این تستها، انتخاب رقیق کننده مناسب برای انجماد منی قوچ برای استفاده در تلقیح مصنوعی و انجام آسان برنامههای اصلاح نژادی و در نهایت گسترش پرورش گوسفند و اقتصادی بودن آن خواهد شد.
1-2- حفظ انجماد منی
حفظ انجماد منی و تلقیح مصنوعی فواید زیادی را برای صنعت پرورش حیوانات اهلی، به ویژه برای بهبود تولید مثلی و ژنتیکیارائه میکنند. اما بزرگترین مانع در حفظ انجماد منی، آسیبی است که به ساختمان اسپرم در طول فرآیند انجماد- ذوب وارد میشود که منجر به باروری ضعیف اسپرم منجمد میگردد (بارباس و همکاران، 2009). در طول سالهای اخیر، ابداع و توسعهی انواع رقیق کنندههای منی جهت انجماد اسپرم و در نتیجه افزایش راندمان و موفقیت تلقیح مصنوعی گسترش زیادی پیدا کرده است. لذا محققین مطالعات گستردهای برای تولید رقیق کنندههایی که بتوانند باعث حفظ انجمادی اسپرم شوند، انجام دادند. از مهمترین مزایای منجمد کردن منی قوچ، میتوان به بارور نمودن همزمان تعداد زیادی میش با استفاده از اسپرم قوچهای با نژاد برتر و چندقلوزا، انتقالآسان منیاز مراکز تولید و جمعآوری به دورترین دامداریها، انجام زایشخارج از فصل تولید مثلی، جلوگیری از انقراض گونههای در معرض خطر اشاره نمود (سالامون و مکسول، 2000).
در تحقیقات مرتبط با حفظ انجماد منی، بسیاری از مطالعات بر تشخیص آسیبهای وارد شده به اسپرم در طول فرآیند انجماد- ذوب تمرکز نمودهاند(تریمچ و همکاران، 1997: مدیروس و همکاران، 2002). در حالیکه، مطالعات فراوان دیگری نیز به استفاده از محافظت کننده‌های مختلف در رقیق کننده منی برای جلوگیری یا کاهش این آسیبها، برای بهبود کیفیت اسپرم بعد از فرآیند انجماد-ذوب تاکید کرده‌اند(تساک ماکدیس، 2010: فیزر و همکاران، 1984 ). بیشتر ارزیابیهای آزمایشگاهی که برای سنجش کیفیت منی استفاده می‌شود، همبستگی بالایی با توان باروری اسپرم ندارند. استفاده از رنگهای فلورسنت با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت و دستگاه فلوسایتومتری، تجزیهو تحلیل گستردهتری از پارامترهای اسپرم مانند زنده مانی، یکپارچگیغشا و DNA، وضعیت آکروزوم، کروماتینوظرفیتدارشدن، عملکرد میتوکندری و تغییرات ساختاری (آپوپتوزیس) اسپرم را فرآهم نموده است (گراهام، 2001).
در بحث رقیق کننده منی برای جلوگیری بهتر از آسیب انجمادی1 به کیفیت اسپرم، محافظت کنندههای انجمادی2 مختلفی برای انجماد اسپرم در چند دهه گذشته استفاده شده است(کری و همکاران، 2000: واتسون، 1976). کیفیت اسپرم پس از ذوب، به دلیل وقوع شوک سرمایی و تنش اسمزی در طی فرآیند انجماد- ذوب کاهش مییابد(سالامون و ویزر، 1972: بیلی و همکاران، 2000). بسیاری از این صدمات را می توان با رقیق کننده مناسب و مواد محافظ انجمادی مانع شد(گیل و همکاران، 200). ترکیبات موجود در رقیق کنندهها باید بتوانند اسپرم را نسبت به شرایط متغیر بوجود آمده حفاظت نموده و حتی الامکان دچار صدمات کمتری کنند(هولت، 1997). غشاهای سلولی در برابر آسیب ناشی از انجماد حساسیت بالایی دارند، به طوریکه طی فرایند سرد شدن تنشی بر غشا اعمال شده که اثرات زیان آوری را به دنبال خواهد داشت. در نتیجهی این تغییر، سلول ممکن است سوراخ شده که منجر به مرگ آن می‌شود(پاپا و مکاران، 2011). علاوه بر این، این تغییر ممکن است منجر به تجزیه ترکیبات سطحی غشا شود. بنابراین حفظ سلامت غشا برای تولید اسپرم با کیفیت، بعد از انجماد بسیار اهمیت دارد(هولت و همکاران، 1992). رقیق کنندههای منی دارای خواص ویژهای هستند که موجب نگهداری طولانی تر اسپرمها میشوند. این مواد در تأمین انرژی مورد نیاز، حفاظت اسپرم از آسیب‌های دمایی، کاهش استرسهای فیزیکی و شیمیایی ناشی از سرد کردن، انجماد-ذوب اسپرمها و در نهایت ایجادیک محیط مناسب برای زنده ماندن موقت اسپرمها نقش دارند(کری، 2000). گلیسرول، دی متیل سولفوکساید و اتیلن گلیکول دارای وزن مولکولی کم بوده و عوامل محافظ انجمادی درون سلولی یا نفوذ کننده هستند و منابع لیپوپروتیینی یا مواد با وزن مولکولی بالا مثل زرده تخم مرغ، شیر یا لسیتین سویا برای جلوگیری از شوک سرمایی و گلوکز یا فروکتوز به عنوان منابع انرژی و سایر افزودنیها مانند آنزیمها و آنتی بیوتیکها به رقیق کننده اضافه میشود(اماموردی و همکاران، 2013). منابع حیوانی مانند زرده تخممرغ، یک جزء طبیعی از رقیق کنندههای منی است که غشای سلول اسپرم را در مقابل شوک سرمایی، در طول انجماد-ذوب محافظت میکند(واتسون، 1981). مکانیسم محافظتی توسط فسفولیپیدها (لسیتین) و لیپوپروتئینهای با چگالی پایین3 انجام میگیرد(ویدسور و وایت، 1997: موکه و همکاران، 2008). مطالعات قبلی نشان داد که اسپرم قوچ میتواند در برابر شوک سرمایی، با افزودن 15 درصد زرده تخم مرغ به رقیق کننده تریس محافظت شود(فیزر و همکاران، 1984). با این حال، زرده تخم مرغ ممکن است آنتاگونیست مواد محافظ انجمادی، حاوی آلودگیهای میکروبی و خطر انتقال بیماریها، تغییرات زیاد در ترکیبات آنها، دشواری مشاهدات میکروسکوپی و سبب ظرفیت دار شدن اولیه اسپرم باشد. پروتئینهای گیاهی مانند لسیتین سویا4، فاقد این ایرادات زرده تخم مرغ میباشند.
در چند سال گذشته رقیقکنندههای جدید حاوی لسیتینسویا برای جایگزینی زرده تخممرغ، به طور گسترده برای انجماد منی استفاده شده است(دل واله و همکاران، 2012: گیل و همکاران، 2003: فوکویی و همکاران، 2007). در نتیجه بهبود حفظ انجماد منی، به تشخیص آسیبهای وارده به کیفیت اسپرم و استفاده از رقیق کننده منی مناسب برای جلوگیری از آسیبهای انجمادی به اسپرم را در طی فرآیند انجماد-ذوب میطلبد.
بنابراین، هدف پژوهش حاضر، بررسی استفاده از سطوح مختلف لسیتین سویا (5/0، 1، 5/1و 2%) و زرده تخم مرغ (10، 15، 17 و20 %) و مقایسه آنها و انتخاب بهترین سطوح آنها برای استفاده در رقیق کننده منی قوچ، ارزیابی اثر آن بر خصوصیات جنبایی، زنده مانی و یکپارچگی غشای اسپرم قوچ در طی انجماد-ذوب میباشد.در طول سالهای اخیر، پژوهشهای بسیاری روی بهبود حفظ انجمادی منی5 قوچ برای گسترش تلقیح مصنوعی صورت گرفته است. بقا و تحرک اسپرم پس از انجماد-ذوب تحت تاثیر فاکتورهای متعددی از قبیل کیفیت منی، نوع و غلظت اجزای موجود در محیط انجماد منی از قبیل غلظت گلیسرول و یا سایر مواد محافظ کننده مانند منابع پروتئینی و لیپوپروتئینی است. این مواد در تأمین انرژی مورد نیاز، حفاظت اسپرم از آسیبهای دمایی، کاهش استرسهای فیزیکی و شیمیایی ناشی از سرد کردن و انجماد- ذوب اسپرمها و در نهایت ایجاد یک محیط مناسب برای حفظ کیفیت اسپرم نقش دارند. بنابراین استفاده از محیط انجماد مناسب منی قوچ که بتواند از اسپرمها در برابر آسیبهای انجماد- ذوب محافظت کند و بقا و تحرک اسپرم را بعد از انجماد- ذوب حفظ کند، گام مهمی در جهت استفاده از اسپرم منجمد در تلقیح مصنوعی گوسفند و مطالعات آزمایشگاهی است.
فرآیند انجماد اسپرم اکثر پستانداران مستلزم گذراندن دو مرحله میباشد. در مرحله اول که دوره خنک کردن6 نامیده میشود، دمای منی رقیق شده از دمای 35-30 درجه به 5 درجه سلسیوس و در مرحله دوم که دوره منجمد کردن میباشد، دمای منی رقیق شده از 5 درجه به 196- درجه سلسیوس در نیتروژن مایع کاهش داده میشود. در مرحله اول برای مقابله با شوک سرمایی، رقیق کنندههای سرمایی به منی اضافه میگردد. این رقیق کنندهها معمولا حاوی لسیتین، پروتئینها و لیپوپروتئینهای زرده تخممرغ میباشند. در ابتدای مرحله دوم که مرحله انجماد است، به منظور حفاظت اسپرم در مقابل صدمات ناشی از تشکیل بلورهای یخ، از رقیق کنندههای انجمادی که حاوی 7-3 درصد گلیسرول است استفاده میشود که موجب حفظ اسمولاریته شده و ظرفیت بافری رقیق کننده را تامین میکند (دیپاز و همکاران، 2010: ویندسور و وایت، 1995). غشاهای سلولی در برابر آسیب ناشی از انجماد دارای حساسیت بالایی میباشند به طوری که در طی فرآیند سرد شدن یک استرس حرارتی بر روی غشا ایجاد شده و منجر به تغییر کریستال مایع به فاز ژلی میشود که در نتیجه اثرات زیان آوری را به دنبال خواهد داشت. در نتیجه این تغییر، سلول ممکن است سوراخ شده و منجر به مرگ سلول شود. علاوه بر آن، این تغییر ممکن است منجر به تجزیه ترکیبات سطحی غشا شود (هولت، 1984). بنابراین حفظ سلامت غشا برای تولید اسپرماتوزواهای با کیفیت بعد از انجماد بسیار اهمیت دارد. کشف خصوصیات حفاظتی گلیسرول در حین انجماد اسپرم در سال 1949 میلادی توسط پولژ باعث شد که بتواند برای اولین بار اسپرم حیوانات را منجمد کند. اینکه چگونه گلیسرول باعث حفظ اسپرم در حین انجماد میشود یک پدیده کاملا شناخته شده است، چون هنوز هم در مورد مکانیسم عمل آن اختلاف نظر وجود دارد. گلیسرول قابلیت نفوذ پذیری بالایی داشته و اثر درون سلولی از خود نشان میدهد. برای مثال اثر آبکشی شدید و بالای گلیسرول باعث کاهش تشکیل کریستالهای یخ درون سلولی میشود. مکانیسمی که گلیسرول باعث آبکشی و کاهش دمای انجمادی میشود به پتانسیل بالای پیوند آبی آن مربوط میشود که درنتیجه غلظت الکترولیتهای آزاد شده افزایش یافته و ساخته شدن کریستالهای یخ به تأخیر افتاده و یا مقدار آن کاهش می یابد که در نتیجه اسپرم در مقابل تغییرات فشار اسمزی و غلظتهای نمک محافظت میشود(مکلاگین و همکاران، 1992). علاوه بر گلیسرول، دی متیل سولفوکساید و اتیلنگلایکول هم استفاده میشوند که دارای وزن مولکولی کم هستند و عوامل محافظ انجمادی درون سلولی یا نفوذ کننده7 نامیده میشوند.
منابع لیپوپروتئینی یا مواد با وزن مولکولی بالا مثل زردهی تخم مرغ، شیر یا لسیتینسویا برای جلوگیری از شوک سرما8 و گلوکز یا فروکتوز به عنوان منابع انرژی و سایر افزودنیها مانند آنزیمها و آنتی بیوتیکها به رقیق کننده اضافه میشود(بلکشاو، 1995). برای تقویت رقیقکنندهها معمولا از ترکیبات با منشا حیوانی نظیر زرده تخممرغ و شیر کامل استفاده میشود. این رقیق کنندهها قادرند احتیاجات مورد نیاز اسپرم را که در بخشهای قبلی ذکرشد، تامین کنند. زرده تخم مرغ نیز یک جزء معمول تشکیل دهنده محیطهای انجماد است و با عمل بر روی غشا سلولی، اسپرم را در برابر شوک سرما محافظت میکند، اما این رقیق کنندهها مشکلاتی نیز با خود دارند به طوریکه درسالهای اخیر بحثهای زیادی را به خود اختصاص دادهاند. یکی ازاین مشکلات، تغییرات زیاد درترکیبات آنهاست به طوریکه استاندارد سازی هر یک از اجزای وی‍ژه و مفید موجود در آن رقیق کننده بر خصوصیات انجمادی اسپرم را با مشکل مواجه میکند. علاوه بر این زرده تخم مرغ و شیر ممکن است حاوی آلودگیهای میکروبی باشند که با تولید سموم، ظرفیت باروری اسپرماتوزوا را شدیدا کاهش داده و حتی باعث از بین رفتن آنها شوند و از همه مهمتر اینکه باعث انتقال بیماریهایی مثل آنفولانزای مرغی شوند. از دیگر مشکلات زردهی تخم مرغ وجود مواد مضر از قبیل پروژسترون است که سبب ظرفیت دار شدن زود هنگام9 اسپرم در طی انجماد میشود. در محیط دارای زردهیتخم مرغ به علت وجود مواد اضافی، مشاهدات میکروسکوپی اسپرم دشوار است. همچنین مواد موجود در زرده سبب مهار تنفس اسپرمها یا کاهش تحرک آنها میشود و نیز سموم اندوتوکسین تولیدی توسط آلودگیهای موجود در زرده تخممرغ باعث کاهش باروری اسپرم میشود. بنابراین آلودگیهای مایکوپلاسمایی و باکتریایی موجود در منابع حیوانی مورد استفاده در انجماد منی و گسترش منیهای منجمد گونههای مختلف در سطح جهان همواره نگرانی گسترش بیما‌ری‌هایی مانند جنون گاوی و آنفلوآنزای مرغی را در سطح جهان در پی داشته است(ابوگلا و همکاران، 2004: امیرات و همکاران، 2004). فراوانی منابع گیاهی و عدم وجود آلودگی منابع گیاهی این ضرورت را ایجاد میکند که این منابع جایگزین منابع حیوانی گردد، به طوریکه منابع گیاهی به ویژه لسیتینسویا در مطالعات زیادی برای انجماد اسپرم گونههای مختلف استفاده شده است که در فصل پیشینه تحقیق به طور کامل بررسی شده است.
1-3- هدف آزمایش
هدف پژوهش حاضر، بررسی استفاده از سطوح مختلف زرده تخم مرغ و لسیتین سویا در رقیق کننده دست ساز و انتخاب بهترین سطوح لیپوپروتئینهای حیوانی و گیاهی در رقیق کننده منی قوچ، ارزیابی اثر آن بر خصوصیات جنبایی، زنده مانی و یکپارچگی غشای اسپرم قوچ در طی انجماد- ذوب بود. لسیتین سویا10 به عنوان منبع گیاهی و زرده تخممرغ به عنوان منبع حیوانی در یک محیط پایه11 برای انجماد اسپرم قوچ در نظر گرفته شدند. بنابراین اهداف این پژوهش شامل:
1- بررسی اثر غلظتهای مختلف لسیتین سویا (5/0، 1، 5/1 و2%) روی جنبایی، زنده مانی، یکپارچگی غشای پلاسمایی و مورفولوژی اسپرم بعد از فرآیند انجماد-ذوب
2- بررسی اثر غلظتهای مختلف زرده تخم مرغ (10، 15، 17 و 20%) روی جنبایی، زنده مانی، یکپارچگی غشای پلاسمایی و مورفولوژی اسپرم بعد از فرآیند انجماد-ذوب
3- تولید یک رقیق کننده دست ساز پایه و مطلوب برای انجام مطالعات بعدی انجماد منی
1-4-پرسش اصلی تحقیق (مساله تحقیق):
از بین دو نوع منبع لسیتین شامل زرده تخم مرغ و لسیتین سویا به عنوان محافظت کننده در برابر شوک سرما کدام یک از آنها و در چه سطحی جهت استفاده در محیط انجماد اسپرم قوچ افشاری در داخل فصل تولیدمثل مناسب هستند؟
فصل دوم
پیشینه تحقیق
2-1- حفظ انجمادی
حفظ انجمادی12 اسپرم ابزار مفیدی برای مطالعات جنین شناسی آزمایشگاهی و تلقیح مصنوعی13 است و بخش اساسی و ضروری در فناوری های تولید مثل به حساب می آید. حفظ انجمادی به معنای ذخیره مواد بیولوژیک از جمله اسپرم در زیر نقطه انجماد آب است، به گونهای که این مواد از بین نروند و جهت ذخیره طولانی مدت اسپرم برای لقاح آزمایشگاهی، مهندسی ژنتیک و تلقیح مصنوعی استفاده شود (ماتسوکا و همکاران، 2006).
2-1-1- کاربرد و فواید حفظ انجمادی منی
حفظ انجمادی یک روش حفظ ژرم پلاسم14 است که در بخشهای کشاورزی، آبزی پروری15، بیوتکنولوژی و حفظ گونههای در معرض انقراض کاربرد دارد(اندرابی و همکاران، 2007). در بخش کشاورزی، حفظ انجمادی ژرم پلاسم برای بهبود ژنتیکی گونههای اهلی، حفظ نژادهای کمیاب و مبادلات بین المللی ژرم پلاسم استفاده میگردد. هم چنین حفظ انجمادی ژرم پلاسم، برای تولید و حفاظت از حیوانات تراریخته16 ضروری است و در بسیاری از مطالعات پزشکی، به ویژه در زمینه ایمونولوژی، ویروسشناسی، نوروبیولوژی، سمشناسی و صنعت داروسازی کاربرد دارد. در مورد گونههای در معرض انقراض، حفظ انجمادی مواد ژنتیکی برای برنامههای مدیریت ژنتیکی آن گونهها و ذخیره منابع ژنتیکی استفاده میشود (هرارا و همکاران، 2006). در قوچ نشان داده شده است که منی منجمد ذخیره شده در طول 27 سال، باروری را تحت تاثیر قرار نمیدهد، که این باعث حفظ منابع ژنتیکی نژادهای بومی می‌شود(سالامون و ویزر، 1972). امروزه، حفظ انجمادی منی کاربردهای بیوتکنولوژیکی بسیاری دارد، از آن جمله که میتواند برای درمان مشکلات کم باروری17 انسان، بیماریهای تهدیدکننده حیات، حفظ منی و DNA گونههای در خطر انقراض و حفظ تنوع زیستی18 مورد استفاده قرار گیرد.
2-1-2- انواع روشهای حفظ انجمادی
دو روش میتواند برای حفظ انجمادی گامت استفاده شود: انجماد آهسته و انجماد سریع19. انجماد آهسته با استفاده از غلظت کم محافظت کنندهها انجمادی همراه است که به سمیت مواد شیمیایی و شوک اسمزی مرتبط است. انجماد سریع یا ویتریفیکاسیون یک روش سریع که باعث کاهش شوک سرمایی میشود، اما معمولا برای اسپرم انجام نمی‌شود، چون انتقال دما20 در سلولهای اسپرم خیلی آهسته است که امکان انجام ویتریفیکاسیون را بدون این که خطرات ناشی از اثرات محلول یا تشکیل بلورهای یخ را برای اسپرم داشته باشد، بدهد(بارباس و همکاران، 2009). معمولا، حفظ انجمادی شامل کاهش درجه حرارت، از دست دادن آب سلولی21، انجماد و ذوب میباشد(مک لاگین و همکاران، 1992). نرخ انجماد باید به اندازه کافی آهسته باشد تا اجازه دهد آب از سلولها توسط روش اسمز خارج شود تا از تشکیل کرسیتالهای یخ داخل سلولی که باعث صدمات برگشت ناپذیر به سلولهای اسپرم میشود، جلوگیری شود.

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

2-1-3- تاریخچه حفظ انجماد منی قوچ
مطالعات بر روی تلقیح مصنوعی در گوسفند، در ابتدای قرن بیستم توسط ایوانف آغاز شد. این مطالعات بر روی رقیق کنندهها و روشهای رقیق سازی منجر به کاربرد آزمایشی تلقیح مصنوعی در گوسفند شد. بعد از جنگ جهانی اول مطالعات گسترده تری تحت رهبری میلووانف آغاز شد و در اوایل سال 1930، تلقیح مصنوعی با استفاده از منی تازه و رقیق شده برای تولید انبوه گوسفندها با استفاده از منی قوچهای با نژاد برتر، انجام شد. بارور نمودن همزمان تعداد زیادی میش با استفاده از اسپرم قوچ های با نژاد برتر، نیازمند انتقال منی از مرکز تولید و جمع آوری به مزارع در فواصل دور است. همچنین امکان استفاده از اسپرم در زمانهای مختلف سال، مشوق محققان برای ذخیره اسپرم در شرایط آزمایشگاهی شد. برای این منظور باید از روشهاییاستفادهمیشدکه با کاهش یا توقف متابولیسم، عمر باروری22 اسپرمها افزایش می‌یافت(سالامون و مکسول، 2000). بر این اساس محققین دو راه برای ذخیره اسپرم پیشنهاد نمودند:
اولین روش بر اساس نگهداری آنها در حالت مایع و کاهش دما به 10-5 و یا 15-10 درجه سلسیوس بود. در این محدوده دمایی متابولیسم اسپرم به شکل برگشت پذیری متوقف میشود. زمانی که اسپرمها در دمای نزدیک به صفر درجه سلسیوس نگهداری شوند، شوک سرمایی میتواند تغییرات برگشت ناپذیری را در اسپرمها ایجاد کند و با افزودن لیپیدها به رقیق کننده و با سرد کردن تدریجی از دمای اتاق می توان مانع ایجاد شوک سرمایی در اسپرم ها شد. نگهداری در حالت مایع تنها برای نگهداری و ذخیره کوتاه مدت امکان پذیر بود. این امر موجب شد تا محققین روش‌های مبتنی بر کاهش دما به زیر صفر درجه سلسیوس، که در آن اسپرم مدت زمان بیشتری نگهداری می شود را جستجو کنند. مطالعات بر روی اثرات دمای زیر صفر درجه سلسیوس بر روی زنده مانی اسپرم متعلق به شخصی به نام اسپالازانی می باشد. وی ویال‌های23 حاول منی پستانداران را در برف قرار داد و بعد از ذوب آنها در دمای اتاق توانست که اسپرم‌های زنده را مشاهده نماید. عدم وجود تجهیزات مناسب برای کاهش دما به زیر 30- درجه سلسیوس محققان را مجبور ساخت تا آزمایشات خود را به دماهای بالاتر از 30- درجه سلسیوس محدود کنند. از این رو گزارش های متعدد اولیه ای مبنی بر انجماد موفقیت آمیز منی پستانداران در دماهای 13-، 17- و 23- درجه سلسیوس وجود دارد. با شروع قرن بیستم و پیشرفت تجهیزات برای کاهش دما تا 200- درجه سلسیوس، تلاشهای اولیه برای انجماد اسپرم در پستانداران در دماهای خیلی پایین تر با شکست مواجه شد. ایوانف با انجماد اسپرم اسب در دمای 100- درجهسلسیوس هیچ اسپرم متحرکی را مشاهده ننمود. این در حالی بود که در دمای 15- درجه سلسیوس انجماد اسپرم اسب با موفقیت انجام شده بود(سالامون و مکسول، 2000).
چند سال بعد گزارشهای موفقیت آمیزی از انجماد اسپرم انسان بر روی یخ خشک24 (70- درجه سلسیوس)، نیتروژن مایع (196- درجه سلسیوس) و هلیوم25 مایع (296- درجه سلسیوس) منتشر شد. با ادامه موفقیت پژوهشگران در انجماد اسپرم پستانداران، مطالعات در زمینه بهینه سازی این تکنیک انجام شد. ماکسیمف نشان داد که سوسپانسیون‌های سلولی از بافتهای گیاهی در یک محلول حاوی گلیسرول قادرند از اسپرم در فرآیند انجماد- ذوب محافظت کنند (سالامون و مکسول، 1995). بررسیهای کامل تر آزمایشگاهی نشان داد که محلول یک مولار گلیسرول میتواند محافظت خوبی را از اسپرم پستانداران (خرگوش، خوک، گاو، قوچ و اسب) در فرآیند انجماد-ذوب نشان دهد. گلیسرول در سطح 18 درصد اثرات سمی بر روی اسپرم داشت(بیلفلد و همکاران، 1990). آزمایش مشهور پولژ و همکاران درسال 1949 منجر به کشف کامل خصوصیات حفاظتی گلیسرول شد. کشف خصوصیات حفاظتی گلیسرول پیشرفت عظیمی در تکنیک انجماد اسپرم بود. بعد از پی بردن به خاصیت محافظتی گلیسرول، آزمایشهای متعددی بعد از سال 1950 بر روی انجماد اسپرم قوچ با رقیق کنندههای حاوی گلیسرول انجام شد.
2-1-4- مراحل حفظ انجمادی منی
پنج مرحله برای حفظ انجمادی منی وجود دارد:
1- رقیق سازی و مواجه شدن با مواد محافظ انجمادی
2- سرد کردن تا دماهای 5-4 درجه سلسیوس
3- قرار گرفتن در معرض بخار ازت و سپس ذخیره سازی در ازت
4- ذوب مجدد و قرار گرفتن در دمای اتاق
5- حذف مواد محافظ انجمادی
2-2- عوامل موثر بر انجماد اسپرم قوچ
حفظ انجمادی موفقیت آمیز اسپرم تحت تاثیر عوامل مختلفی است. از جمله این عوامل می توان به رقیق کننده، مواد محافظتی موجود در آنها، روش اضافه کردن این مواد به رقیق کننده، نرخ سرد سازی و روش‌های ذوب اشاره نمود (اماموردی و همکاران، 2013). تلاشهای قابل توجهی برای ایجاد روشهای بهینه و ترکیب بهینهای از این عوامل جهت حفظ تحرک، سلامت و استحکام غشا بعد از انجماد-ذوب صورت گرفته است. هر کدام از این عوامل با توجه به شرایط لازم برای دستیابی به بهترین نتیجه برای باروری اسپرم بعد از انجماد-ذوب دنبال میشوند.
2-2-1- رقیق کننده ها
پلاسمای منی حاوی مقادیر نسبتا بالایی از گلیکوپروتئینها، گلیکولپیدها و هورمونها میباشد. این مواد باعث محافظت از اسپرم بعد از انزال شده و انتقال اسپرم به دستگاه تناسلی ماده را تسهیل و باعث جلوگیری از ظرفیت یابی26 زود هنگام اسپرم می شود. به هر حال پلاسمای منی تنها قادر است که به میزان کمی از اسپرم در مقابل صدمات ناشی از سردسازی در فرآیند انجماد- ذوب محافظت نماید. برای ذخیره سازی در دماهای پایین نیاز به رقیق کردن سیمن در رقیق کنندههای خاص میباشد. این رقیق کنندهها باید به طور کلی دارای اسیدیته، ظرفیت بافرینگ27 و اسمولاریتی28 مناسبی باشند و بتوانند از اسپرم در مقابل صدمات ناشی از فرآیند انجماد-ذوب محافظت کنند(سالامون و مکسول، 2000). در ادامه به تعدادی از این رقیق کننده ها که تاکنون مورد استفاده قرار گرفته اند به اختصار اشاره میشود.
تریس (هیدروکسی متیل آمینومتان29) جزء اصلی رقیق کنندههای امروزی برای انجماد منی گاو، قوچ و سایر گونهها میباشد. این بافر دارای ظرفیت بافرینگ و اسموتیک بسیار خوبی میباشد و خاصیت سمیت آن در مقایسه با سایر بافرها کمتر میباشد. مطالعات متعدد نشان داده است که تریس به عنوان بهترین بافر برای رقیق سازی منی در اکثر گونههای پستانداران عمل می کند(سالامون و مکسول، 1995). بررسی مقایسهای تریس به عنوان بافر رقیق کنندهها برای رقیق سازی و انجماد اسپرم قوچ نشان داد که بافر تریس در کنار گلوکز اثرات محافظتی بهتری نسبت به سایر قندها همچون فروکتوز، لاکتوز و رافینوز دارد(شانون و همکاران، 1995). البته تحقیقات بیشتر نشان داد که فروکتوز هم در کنار بافر تریس اثرات بهتری نسبت به سایر قندها دارد و اسپرم منجمد شده در رقیق کنندههای بر پایه تریس، درصد بره زایی قابل قبولی را در مقایسه با سایر رقیق کنندهها نشان میدهند.سالامون و همکاران نشان دادند که رقیق کنندههای بر پایه تریس با 2% زرده تخم مرغ، جنبایی و کلاهک آکروزم اسپرم قوچ را پس از انجماد-ذوب تا حد قابل قبولی حفظ میکند. بیشتر رقیق کنندههای تجاری امروز که برای رقیق سازی منی گاو و گوسفند استفاده میشود، بر پایه بافر تریس میباشند.
2-2-3- مواد نگهدارنده یا محافظت کنندهها
2-2-3-1- مواد نگهدارنده درون سلولی یا نفود کننده
تمام روشهای انجماد سلولی بر اساس استفاده از یک یا چند ماده محافظ انجماد است. لازمه یک محافظ انجمادی، بالا بودن قدرت نفوذ و سمیت پایین30 آن میباشد. گلیسرول، دی متیل سولفوکساید و اتیلن گلیکول، عوامل محافظ انجمادی درون سلولی یا نفوذ کننده31 هستند، که وزن مولکولی آنها نسبتا کم است. این مواد از تجمع مولکولهای آب با یکدیگر برای تشکیل کریستالهای یخ در درون اسپرم جلوگیری میکنند و برای آبگیری آب داخل سلولی ضروری هستند. همچنین نقطه انجماد پایین آنها، زمان بیشتری برای آبگیری ایجاد میکند. علاوه براین به عنوان حلال32، سبب حل شدن قندهای غیر قابل حل در محیط رقیق کننده میشوند (عبدالحکیم و همکاران، 1991).
در طی فرآیند انجماد- ذوب، شوک سرمایی به شدت فسفولپیدهای و گلیکوپروتئینهای موجود در سطح غشا را تحت تاثیر قرار میدهد و باعث شروع آسیبهای ساختاری و بیوشیمیایی میشود. برای جلوگیری از این آسیبها علاوه بر مواد محافظ درون سلولی، به مواد محافظ خارج سلولی یا نفوذ ناپذیر نیز نیازمند است. این مواد عمدتا لیپوپروتئینها و پروتئینهای موجود در منابعی همچون زرده تخم مرغ، شیر و منابع گیاهی لسیتین سویا است. این مواد با عمل بر روی غشاء سلولی، اسپرم را در برابر شوک سرما محافظت میکند(سالامون و مکسول، 1995). استفاده از مواد محافظتی در غلظتهای پایین ممکن است که برای حفاظت از اسپرم کافی نباشد و غلظت بالای آنها نیز ممکن است که برای اسپرم سمی باشد. شرایط بهینه هر کدام از این مواد محافظ برای دستیابی به بهترین باروی در ادامه دنبال میشود. گلیسرول معمول ترین ماده محافظ انجمادی است که قادر است به درون سلول نفوذ کند(سالامون و ویزر، 1972). کشف خصوصیات حفاظتی گلیسرول توسط پولژ در سال 1949 تاثیر بسیار عظیمی در تکنولوژی پیچیده انجماد اسپرم داشت. خاصیت حفاظتی گلیسرول مربوط به توانایی برقراری پیوند آن با آب است و با افزایش حلالیت نمک در رقیق کنندهها باعث کاهش فشار اسمزی رقیق کننده می‌شود. افزودن گلیسرول به منی قبل از انجماد، شامل مرحله موازنه است که در طی این مرحله آب درون سلولی اسپرم بواسطه شیب اسمزی خارج شده و گلیسرول جایگزین آن میشود و بدین ترتیب مانع تشکیل کریستالهای یخ درون سلولی شده و سلولها را در برابر آسیب حاصل از تشکیل کریستالهای یخ محافظت میکند.
علاوه بر گلیسرول، چندین ماده محافظ درون سلولی دیگر نیز برای انجماد اسپرم پستانداران مورد بررسی قرار گرفته است. دی متیل سولفوکساید وقتی که برای اولین بار به عنوان ماده جایگزین گلیسرول مورد استفاده قرار گرفت، باعث کاهش تحرک و زنده مانی اسپرم بعد از انجماد- ذوب شد(هولت، 1994). با این حال ترکیب 5/1 درصد دی متیل سولفوکساید همراه با 7 درصد گلیسرول در مقایسه با رقیق کننده حاوی تنها 5 درصد دی متیل سولفوکساید بهتر بود(سالامون و مکسول، 1995). غلظت 2 درصد اتیلن گلایکول میتواند از اسپرم در فرآیند انجماد- ذوب محافظت کند و اختلاف معنی داری با رقیق کننده حاوی 5/3 درصد گلیسرول از نظر تحرک و زنده مانی نشان نداد. در آزمایش دیگر حضور 5 درصداتیلن گلایکول در مقایسه با 5 درصد گلیسرول در رقیق کننده سیمن قوچ باعث کاهش معنی داری در زنده مانی اسپرم در گروه اتیلن گردید. درصد بره زایی33 در میشهای تلقیح شده با اسپرم منجمد شده در رقیق کنندههای حاوی 5/3 درصد گلیسرول و 75/1 درصد اتیلن گلایکول اختلاف معنی داری نشان نداد(سالامون و ویزر، 1972). در طول سالیان مختلف نگهدارندههای متعددی برای رقیق سازی منی پستانداران مورد بررسی قرار گرفتهاند که هیچکدام از آنها نتوانستند همانند گلیسرول عمل نمایند.
2-2-3-2- مواد نگهدارنده برون سلولی یا نفود ناپذیر
زرده تخم مرغ
از سال 1939 وقتی که فیلیپس و همکاران اثرات مثبت زرده تخم مرغ رابرای ذخیره سازی منی پستانداران کشف نمودند، زرده به عنوان یکی از اجزای معمول در محیط انجماد اسپرم پستاندارن مورد استفاده قرار گرفت (فیلیپس، 1939). زرده تخم مرغ، اسپرم را در برابر شوک سرمایی محافظت میکند. زرده در سطح غشای پلاسمایی سلول عمل میکند و نقش آن بر خلاف گلیسرول خارج سلولی است. علاوه بر اثرات مثبت زرده در طی فرآیند سرد سازی از دمای اتاق به دمای صفر درجه سلسیوس، در طی دوره انجماد نیز اسپرم از زرده برای محافظت از خود در برابر شوک سرمایی استفاده میکند. جنبایی34، زنده مانی، سلامت آکروزوم و غشای میتوکندریایی اسپرم در طول استرسهای فیزیکی و شیمیایی میتواند با حضور زرده در رقیق کننده تا حد قابل قبولی حفظ شود. زرده به عنوان یک بافر اسموتیک با حضور در رقیق کننده قادر است تحمل اسپرم را به هر دو نوع محیط هایپرتونیک و هایپوتونیک افزایش دهد. ثابت شده است که اثر محفاظتی زرده تخم مرغ برای اسپرم گاو بیشتر از قوچ است (سالامون و مکسول، 1995).

در مورد مکانیسم دقیق اثر زرده تخم مرغ اطلاعات دقیقی در دسترس نیست و فرضیههای متنوعیدرباره این اثر وجود دارد. لیپوپروتئینهای با چگالی کم35 (LDL) بخش تاثیر گذار زرده تخم مرغ است که با اتصال به غشای اسپرم در طی فرآیند انجماد-ذوب، باعث مقاومت اسپرم در برابر آسیبهای حرارتی می‌شود(واتسون و همکاران، 1975). به هر حال نقش کامل پروتئینها و لپیدهای موجود در LDL در برقراری پیوند و ارتباط با غشای اسپرم هنوز به طورکامل مشخص نیست. همچنین LDL حاوی مقادیری فسفاتیدیلکولین و فسفاتیدلسرین است که درطیفرآیند انجماد-ذوب به طور مرتب جایگزین فسفولیپدهای از دست رفته غشای اسپرم میشوند(گیلان و همکاران، 2005). فسفولپیدها میتوانند یک لایه محافظتی در اطراف غشای اسپرم تشکیل دهند. این پرده محافظتی در زمان شکسته شدن مولکولهای LDL به وجود میآید(ولنته و همکاران، 2010). جذب و ژلاتینه شدن آپوپروتئینهای36 LDL در اطراف غشای اسپرم باعث تشکیل یک غشای محافظتی در مقابل کریستالهای یخ در اطراف غشای اسپرم شود. فرضیهای دیگر در این مورد این است که لیپوپروتئینهای با چگالی کم با پپتیدهای کاتتیونیک37 موجود در پلاسمای منی برای اتصال به غشای اسپرم رقابت میکند. این پپتیدها که وزن مولکولی کمتر از 5 کیلو دالتون دارند، میتوانند با اتصال به غشای اسپرم باعث خارج شدن کلسترول از سطح غشا شوند(موکه و همکاران، 2008).

دسته بندی : پایان نامه ها

پاسخ دهید